1樓：匿名使用者
你的目的基因兩端加了酶切位點麼？或者目的基因轉錄序列的外側有沒有酶切位點？有的話雙酶切再連線。沒有的話建議你設計帶酶切位點的接頭，然後再連到t載體上去。
這樣。你先把含t載體的菌搖起來，提質粒，雙酶切，割膠**酶切片段（小的那一段，就是你要的基因）。2301載體你看看有沒有那兩個酶切位點，同尾酶也可以，雙酶切，**切開的載體。
然後把載體和基因片段連線，轉化感受態細菌，挑平板，就行了。不要用菌液，要用提出的質粒！酶切體系你購買酶的時候會告訴你的。
2樓：浙大阿米巴
請說清楚，不是每個人都在從事和你一樣的工作。
構建質粒表達載體為什麼要先連t載再連pmv261?
3樓：
先連線t載體是為了提高轉化效率
一般來說市面上**的t載體都進行了優化，容易連線片段（也就是效率較高），因此構建表達載體時有時會先連線t載體。同時t載體的測序引物比較明確（商業化的緣故），因此測序也方便一些。更重要的是，t載體往往設計了藍白斑篩選的功能，插入片段的載體會呈現白色，這樣也容易區分驗證，不用每個單菌落都拿去做colony pcr或提質粒酶切驗證。
當然也不是絕對的，我們實驗室就經常直接把片段酶切後連線表達載體，不經過t載體這一步，其實影響並不大。如果你的情況比較特殊（比如片段較大，或是對應的表達載體拷貝數較低等），可以考慮連線t載體，不然的話不是非常必要。
我有一個基因片段老是正向連線到pmd18-t載體上，我現在想要它反向連線上去，有什麼好的方法嗎？
4樓：匿名使用者
在插入序列2端用pcr連線上不同的酶切位點（和載體的位置相對），用酶處理pcr產物和載體，然後再連線就可以了。
5樓：匿名使用者
要麼你像樓上說的那樣，做定向克隆；我想你的本意就是要避免換個引物再亞克隆一次，所以你
內只能多篩一些克隆容，可以用 m13f+你特異基因的f引物 批量做菌落pcr驗證（或m13r+特異基因的r），擴出條帶就是反向插入了。如果p了上百個克隆還 沒有，勸你放棄吧，還是定向克隆吧。
為什麼要進行亞克隆？一個基因已經克隆到t載體上了，想表達它，為什麼還要進行亞克隆，連到pet40b呢
6樓：匿名使用者
t載體一般是克隆載體，需要克隆到表達載體，用相應的啟動子啟動表達
7樓：
t載體不是表達載體。
第二題中，什麼是目的基因與載體之間的反向連線，為什麼避免這個可以提高重組質粒的比例
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