常用的蛋白質含量測定方法有哪些,國家標準檢測蛋白質含量測定方法

2021-05-05 18:48:46 字數 5840 閱讀 2901

1樓:匿名使用者

①凱氏定氮法

原理:蛋白質平均含氮量為16%。當樣品與濃硫酸共熱,蛋白氮轉化為銨鹽,在強鹼性條件下將氨蒸出,用加有指示劑的硼酸吸收,最後用標準酸滴定硼酸,通過標準酸的用量即可求出蛋白質中的含氮量和蛋白質含量。

②雙縮脲法

原理:尿素在180℃下脫氨生成雙縮脲,在鹼性溶液中雙縮脲可與cu2+形成穩定的紫紅色絡合物。蛋白質中的肽鍵實際上就是醯胺鍵,故多肽、蛋白質等都有雙縮脲(biuret)反應,產生藍色或紫色複合物。

比色定蛋白質含量。

缺點:靈敏度低,樣品必須可溶,在大量糖類共存和含有脯氨酸的肽中顯色不好。其 精確度 較差 (數mg),且會受樣品中 硫酸銨 及 tris 的干擾,但 準確度 較高,不受蛋白質的種類影響。

③folin酚法(lowry)

folin酚法是biuret 法的延伸,所用試劑由試劑甲和乙兩部分組成。試劑甲相當於雙縮脲試劑(鹼性銅試劑),試劑乙中含有磷鉬酸和磷鎢酸。

在鹼性條件下,蛋白質中的巰基和酚基等可將cu2+還原成cu+, cu+能定量地與folin-酚試劑反應生成藍色物質,600nm比色測定蛋白質含量。

靈敏度較高(約 0.1 mg),但較麻煩,也會受 硫酸銨 及 硫醇化合物 的干擾。 步驟中各項試劑的混合,要特別注意均勻澈底,否則會有大誤差。

④紫外法

280nm光吸收法:利用tyr在280nm在吸收進行測定。

280nm-260nm的吸收差法:若樣品液中有少量核酸共存按下式計算:

蛋白質濃度(mg/ml)=1.24e280-0.74e260 (280 260為角標)

⑤色素結合法(bradford 法)

直接測定法:利用蛋白質與色素分子(coomassie brilliant blue g-250)結合物的光吸收用分光光度法進行測定。

考馬斯亮蘭(cbg)染色法測定蛋白質含量。cbg 有點像指示劑,會在不同的酸鹼度下變色;在酸性下是茶色,在中性下為藍色。當 cbg接到蛋白質上去的時候,因為蛋白質會提供 cbg一個較為中性的環境,因此會變成藍色。

當樣本中的蛋白質越多,吸到蛋白質上的cbg也多,藍色也會增強。因此,藍色的呈色強度,是與樣本中的蛋白質量成正比。

間接測定法:蛋白質與某些酸性或鹼性色素分子結合形成不溶性的鹽沉澱。用分光光度計測定未結合的色素,以每克樣品結合色素的量來表示蛋白質含量的多少。

⑥bca法

bca(bicinchoninc acid procedure,4,4』-二羧-2,2』-二喹啉)法與lowry法相似,主要差別在鹼性溶液中,蛋白質使cu2+轉變cu+後,進一步以bca 取代folin試劑與cu+結合產生深紫色,在波長562 nm有強的吸收。

它的優點在於鹼性溶液中bca 比folin試劑穩定,因此bca與鹼性銅離子溶液結合的呈色反應只需一步驟即完成。靈敏度lowry法相似。

本方法對於陰離子、非離子性及二性離子的清潔劑和尿素較具容忍度,較不受干擾,但會受還原糖 及edta的干擾。

⑦膠體金測定法

膠體金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶膠,呈洋紅色,具有高電子密度,並能與多種生物大分子結合。

膠體金是一種帶負電荷的疏水膠體遇蛋白質轉變為藍色,顏色的改變與蛋白質有定量關係,可用於蛋白質的定量測定。

⑧其他方法

有些蛋白質含有特殊的 非蛋白質基團,如 過氧化物酶含有 亞鐵血紅素基團,可測 403 nm 波長的吸光來定量之。 含特殊金屬的酶 (如鎘),則可追蹤該金屬。

2樓:李樹的戀愛

測定蛋白質的方法可分為兩大類:一類是利用蛋白質的共性,即含氮量、肽鍵和折射率測定蛋白質含量;另一類是利用蛋白質中特定氨基酸殘基、酸性和鹼性基團以及芳香基團等測定蛋白質含量。常見的方法有:

凱氏定氮法、雙縮脲法、酚試劑法及紫外吸收法。

1.凱氏定氮法

準備4個50ml凱氏燒瓶並標號,想1、2號燒瓶中加入定量的蛋白質樣品,另外兩個燒瓶作為對照,在每個燒瓶中加入硫酸鉀-硫酸銅混合物,再加入濃硫酸,將4個燒瓶放到消化架上進行消化,之後進行蒸餾,全部蒸餾完畢後用標準鹽酸滴定各燒瓶中收集的氨量,直至指示劑混合液由綠色變回淡紫紅色,即為滴定終點,結算出蛋白質含量。

2.雙縮脲法

雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法,硫銨不干擾顯色, cu2+與蛋白質的肽鍵,以及酪氨酸殘基絡合,形成紫藍色絡合物,此物在540nm波長處有最大吸收。首先利用標準蛋白溶液和雙縮脲試劑繪製標準曲線,將待測血清與硫酸鈉在待測試管中混合,並用只加入硫酸鈉不含血清的試管作為對照,將兩支試管加入等量的雙縮脲試劑,充分混合後於37℃環境中放置10分鐘,在540nm波長進行比色,以對照管調零,讀取吸光度值,由標準曲線上直接查出蛋白質含量。雙縮脲法常用於0.

5g/l~10g/l含量的蛋白質溶液測定。

3.酚試劑法

取6支試管分別標號,前5支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液,最後一支試管加待測蛋白質溶液,不加標準蛋白溶液,每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致,將液體混合均勻,在室溫下放置30分鐘,以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照,於650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值

4.紫外吸收法

大多數蛋白質在280nm波長處有特徵的最大吸收,這是由於蛋白質中有酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸存在,可用於測定0.1~0.5mg/ml含量的蛋白質溶液。

取9支試管分別標號,前8支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液,1號試管不加標準蛋白溶液,最後一支試管加待測蛋白質溶液,而不加標準蛋白溶液,每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致,將液體混合均勻,在280nm波長處進行比色,記錄吸光度值。

5.其他

除了以上介紹的方法之外,考馬斯亮藍法、二喹啉甲酸法等均可用於蛋白質測定。

國家標準檢測蛋白質含量測定方法

3樓:匿名使用者

蛋白質含量測定方法就是檢測n元素的含量,像三聚氰胺的問題,就是通過增加n的含量使「蛋白質」含量提高的。

國家標準檢測蛋白質含量的方法叫做凱氏定氮法,食物中的蛋白質在催化加熱條件下分解,導致氨和硫酸結合產生硫酸銨。 鹼蒸餾採用無硫,硼酸吸收,用硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定,根據酸耗計算氮含量,再乘以轉化係數,即蛋白質含量。

具體操作步驟如下:

1.樣品處理

精確稱量0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸收10-20ml液體樣品(約30-40mg氮當量)。

將其轉移至乾燥的100毫升或500毫升氮氣固定瓶中,加入0.2克硫酸銅,6克硫酸鉀和20毫升硫酸,輕輕搖動,在瓶口放置一個小漏斗,將瓶子傾斜石棉網上有45度角,有小孔。

加熱小火後,內容物碳化,泡沫完全停止,加強火力,保持瓶內液體稍微沸騰,直至液體呈藍綠色澄清透明,然後繼續加熱0.5小時。取出並冷卻,小心加入20毫升水,冷卻,移入100毫升容量瓶中,用少量水洗淨氮氣瓶,洗淨液放入容量瓶中,然後用水沖洗至刻度,混勻備用。

取相同量的硫酸銅,硫酸鉀和濃硫酸作為試劑進行空白試驗。然而,這種方法很危險,很難在實驗室中證明。大多數實驗室都有一個消化器,可以一次處理16個以上的樣品和一個可以自行設定溫度的呼吸機。

它更安全,更可操作。

2.裝好定氮裝置

根據附圖安裝氮固定裝置。 在約2/3的水蒸氣發生器中加入幾滴甲基紅指示劑和幾毫升硫酸以保持水呈酸性。 新增幾個玻璃珠以防止突然沸騰。 蒸汽發生瓶中的水由壓力調節器加熱。

3.向接收瓶內加入試劑

將10ml 2%硼酸溶液和一滴混合指示劑加入到接收瓶中,並將冷凝管的下端插入液麵下。將10.0ml樣品消化液從小玻璃吸收到反應室中,用10ml水洗滌小燒杯以流入反應室,並擰緊小玻璃棒玻璃塞。

將10ml 40%氫氧化鈉溶液倒入小玻璃杯中,抬起玻璃塞使其緩慢流入反應室,不能立即將玻璃蓋塞緊,這樣容易使玻璃塞粘在樣品入口處,應先用蒸餾水清洗然後蓋上,並在小玻璃杯中加水以防止洩漏。

夾緊螺旋夾並開始蒸餾。蒸汽進入反應室,氨通過冷凝管進入接收瓶。蒸餾持續5分鐘。

移動接收瓶,使冷凝管的下端離開液體容器,然後蒸餾1分鐘,然後用少量水沖洗冷凝管下端的外端。取下接收瓶,將其置於0.05n硫酸或0.

05n鹽酸標準溶液中,以灰色或藍紫色為目的地。

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除了凱氏定氮法以外,標準的測量方法還有:

分光光度法

食品中的蛋白質在催化加熱條件下被分解,分解產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨,在ph4.8的乙酸鈉-乙酸緩衝溶液中與乙醯丙酮和甲醛反應生成黃色的3,5-二乙醯-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長400nm 下測定吸光度值,與標準系列比較定量,結果乘以換算係數,即為蛋白質含量。

燃燒法樣品在900~1200℃下燃燒。在燃燒過程中,產生混合氣體。 諸如碳,硫和鹽的干擾氣體被吸收管吸收,氮氧化物被還原成氮。 形成的氮氣流由熱導檢測器(tcd)檢測。

4樓:life大林子

蛋白質含量測定主要有五

種方法,分別是凱式定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法、酚試劑法和考馬斯亮藍法。

1.凱氏定氮法:

蛋白質是含氮的化合物。食品與濃硫酸和催化劑共同加熱消化,使蛋白質分解,產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨,留在消化液中,然後加鹼蒸餾使氨遊離,用硼酸吸收後,再用鹽酸標準溶液滴定,根據酸的消耗量來乘以蛋白質換算係數,即得蛋白質含量。因為食品中除蛋白質外,還含有其它含氮物質,所以此蛋白質稱為粗蛋白。

2.雙縮脲定氮法:

在強鹼性溶液中,雙縮脲與cuso4形成紫色絡合物,稱為雙縮脲反應。凡具有兩個醯胺基或兩個直接連線的肽鍵,或能過一箇中間碳原子相連的肽鍵,這類化合物都有雙縮脲反應。紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比,而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關,故可用來測定蛋白質含量。

測定範圍為1~10mg蛋白質。干擾這一測定的物質主要有:硫酸銨、tris緩衝液和某些氨基酸等。

3.紫外吸收定氮法:

蛋白質分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵,使蛋白質具有吸收紫外光的性質。形成顏色產物的量取決於蛋白質的濃度。實際測定時,必須預先用標準蛋白質溶液製作一個標準校正曲線,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白質標準溶液。

不同濃度的標準蛋白質溶液加入雙縮脲試劑後,反應生成的顏色產物用紫外-可見分光光度計在540nm 波長下測定吸光度,以雙縮脲試劑加緩衝或水作空白對照。然後將測得的值分別對蛋白濃度(mg/ ml) 作圖,得標準曲線。

未知蛋白樣品用雙縮脲試劑做同樣處理,根據測得吸光度值在標準曲線上直接查得未知蛋白質樣品中得蛋白質濃度。進行紫外吸收法測定時,由於蛋白質吸收高峰常因ph的改變而有變化,因此要注意溶液的ph值,測定樣品時的ph要與測定標準曲線的ph相一致。

4.酚試劑法:

此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的,只是加入了第二種試劑,即folin —酚試劑,以增加顯色量,從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產生深藍色的原因是:

①在鹼性條件下,蛋白質中的肽鍵與銅結合生成複合物。

②folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產生深藍色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下,藍色深度與蛋白的量成正比。

5.考馬斯亮藍法:

考馬斯亮蘭g-250染料,在酸性溶液中與蛋白質結合,使染料的最大吸收峰的位置(λmax),由465nm變為595nm,溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。經研究認為,染料主要是與蛋白質中的鹼性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結合。在595nm下測定的吸光度值a595,與蛋白質濃度成正比。

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檢查過程

(1) 標準法制定標準曲線 取14支試管,分兩組按下表a平行操作。 繪製標準曲線:以a595nm為縱座標,標準蛋白含量為橫座標,在座標紙上繪製標準曲線。

(2) 微量法制定標準曲線 取12支試管,分兩組按下表b平行操作。 繪製標準曲線:以a595nm為縱座標,標準蛋白含量為橫座標,在座標紙上繪製標準曲線。

(3) 未知樣品蛋白質濃度測定 測定方法同上,取合適的未知樣品體積,使其測定值在標準曲線的直線範圍內。根據所測定的a595nm值,在標準曲線上查出其相當於標準蛋白的量,從而計算出未知樣品的蛋白質濃度(mg/ml)。

常用來測定蛋白質含量的方法有哪些,優缺點是什麼

凱氏定氮法 原理 蛋白質平均含氮量為16 當樣品與濃硫酸共熱,蛋白氮轉化為銨鹽,在強鹼性條件下將氨蒸出,用加有指示劑的硼酸吸收,最後用標準酸滴定硼酸,通過標準酸的用量即可求出蛋白質中的含氮量和蛋白質含量。雙縮脲法 原理 尿素在180 下脫氨生成雙縮脲,在鹼性溶液中雙縮脲可與cu2 形成穩定的紫紅色絡...

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